‏290.00 ₪

שאלת המחקר:

כיצד בא לידי ביטוי תהליך האפופטוזיס?

תוכן עניינים:

תקציר

1 . סקירת ספרות

1.1 מבוא למערכת החיסון

1.2 אינטרפרון

0 1.3 אפופטוזיס

1.4 תאי WISH , החלבון FADD-DN , IFN-YNS

 הצגת הבעיה, שאלות המחקר והשערה 17

2 . שיטות וחומרים 2.1 בדיקה וכימות חלבונים אפופטוטטיים בשיטת Western Blot 2.2

צביעת תאים חיים בעזרת Trypan Blue

2.1 השתקת גנים בשיטת siRNA

בדיקת השפעת ריכוזי אינטרפרון שונים על התאים

תוצאות הניסויים 3.1 בדיקה וכימות חלבונים אפופטוטטיים בשיטת Western Blot 16

צביעת תאים חיים בעזרת Trypan Blue

3.3 השתקת גנים בשיטת siRNA 1

בדיקת השפעת ריכוזי אינטרפרון שונים על התאים

דיון בתוצאות מסקנות מהניסויים

הצעות להמשך עבודה

ביבליוגרפיה

נספחים

אפופטוזיס - זהו מנגנון המאפשר מוות תאי מתוכנן באורגניזמים רב תאיים. מגנון זה מופעל על ידי קבלת אות מחוץ לתא או מתוכו (הפעלה אקסטרינזית או אינטרינזית), כאשר יש סממנים מזהים לכל אחת מדרכי האיתחול שלו. עם קבלת האות, מתרחשת סדרה של תגובות ביוכימיות המערבות את הגרעין, הציטופלזמה, וקרום התא שמובילות בסופו של דבר לשינוי בלתי הפיך בתא. הפנוטיפ האפופטוטי מתבטא בהתעגלות התא, קריסת שלד התא, דחיסת הציטופלזמה, קיטוע ^DNA, ויצירה של גופים אפופטוטיים - חתיכות של תכולת התא עטופות בקרום, הנבלעים ומעוכלים על ידי פגוציטים. (נספח מס׳ 4) ישנן מחלות רבות הקשורות באפופטוזיס, בין אם מדובר בהתרחשות מועטה מידיי של האפופטוזיס (לדוגמא, סרטן או מחלות אוטואימוניות) או בביטוי יתר של אפופטוזיס (כגון אלצהיימר ופרקינסון). האפופטוזיס מהווה חלק חשוב בהתמיינות תאים לרקמות, בסילוק תאים נושאי גנים פגומים או המשתכפלים ללא בקרה, ובעצירה של התרבות וירוסים בתאי הגוף. מערכת האפופטוזיס מופעלת על-ידי גירויים סביבתיים שונים, למשל קרינת UV או קרינת גמא, תרופות כימותרפיות או קליטת אותות ביוכימיים. 

מולקולות אינטרפרון מסוג 1- מופרשות מתאי דם לבנים במהלך פעילותה של מערכת החיסון כנגד ווירוסים. בקשירתם לרצפטורים ייחודיים על גבי תאי היעד, מפעילים אינטרפרונים מסלולי הגנה אנטי-ויראליים בתאים וחלקם אף משרים מוות תאי מתוכנן-אפופטוזיס-בתאים אלו. מסלול כניסתם של תאים לאפופטוזיס במתן אינטרפרון אינו ברור, אך קיימת השערה לפיה תיווך של מולקולת ליגנד המוות TRAIL נחוץ לשם הוצאה לפועל של התהליך. לפי השערה זו, היווצרות תצמיד המכונה DISC ( Death Inducing Signaling Complex ( הכולל את קולטניו של TRAIL , שני חלבונים מתאמים FADD ושני אנזימי caspase-8 הכרחי לשם העברת האות מהסביבה החוץ-תאית לתווך התוך-תאי והמשך הקסקאדה בציטופלזמה. במעבדתו של פרופ' גדעון שרייבר נמצא כי מתן אינטרפרון לתאים מכניס אותם לאפופטוזיס, אך ללא מעורבות של ליגנד המוות. בעבודה זו נבדקה השאלה- האם הווצרות מבנה DISC הכרחית לכניסתם של התאים לאפופטוזיס במתן אינטרפרון. על מנת לבדוק האם מבנה ה- DISC חיוני, שיבשנו אותו על-ידי ביטוי של החלבון הרקומביננטי FADD-DN בתאים. לחלבון זה חסר דומיין הקשירה לאנזים caspase-8 ולכן בנוכחותו לא מועברים האותות הביוכימיים הלאה. במעבדה, ניתן טיפול באינטרפרון לתאים המבטאים FADD בלבד, ולתאים המבטאים בנוסף גם את החלבון FADD-DN . לאורך כל הניסויים נראה כי תאים המבטאים את החלבון FADD-DN היו עמידים בפני מתן אינטרפרון ולא נכנסו למוות תאי, לעומת תאי FADD שהראו סממנים אפופטוטיים. יתר על כן, מספרם של תאי ה- FADD-DN היה גבוה משל תאים המבטאים את ה FADD- הטבעי בלבד. מתוצאות הניסויים אנו למדים כי ביטוי יתר של החלבון FADD-DN הביא לחסימה של הפעילות האפופטוטית בתאים, ואף גרם לתאים לגדול מהר יותר. המסקנה העיקרית העולה מתוצאות הניסוי היא חיוניותו של מבנה ה- DISC התקין בכניסתם של תאים לאפופטוזיס לאחר מתן אינטרפרון. מסקנה נוספת העולה מתוצאות הניסוי הינה כי הגן המקודד ל- FADD הינו גן בעל יותר מפנוטיפ אחד-גן פליאוטרופי. הפנוטיפ אותו בדקנו בניסוי הוא המעורבות במסלול העברת האותות המוביל לאפופטוזיס במתן אינטרפרון, ואילו לאורך הניסויים גילינו כי קיים גם אפקט המתגלה בתאים אשר לא טופלו באינטרפרון. בעזרת המסקנות מניסויים אלו, וניסויים שניתן לערוך בעתיד, ניתן יהיה לאפיין באופן מדויק יותר את מסלול העברת האותות הבין-תאי.

לינק למצגת אקדמית על אפופטוזיס ב-99 שח

(בעבודה האקדמית כ-20 מקורות אקדמיים באנגלית ובעברית)

ביבליוגרפיה לדוגמא:

 Chawla-Sarkar M. et al, "Apoptosis and interferons: Role of interferon-stimulated genes as mediators of apoptosis", Kluwer Academic Publishers,

. 237-249. 1. Chen et al.

 issecting the roles of DR4, DR5 and cFLIP in the regulation of Geranylgeranyltransferase I inhibitionmediated augmentation of TRAIL-induced apoptosis. Molecular Cancer, 9:23.